INTRODUCTION

Au sein du règne des champignons renfermant suivant les auteurs de 65 000 à 100 000 espèces différentes, les moisissures constituent un ensemble hétérogène d'environ 20 000 espèces. Ces microorganismes eucaryotes appartiennent en majorité à 3 classes : Zygomycètes, Deutéromycètes et Ascomycètes. Ce sont des champignons microscopiques filamenteux possédant la capacité de se développer sur des substrats nutritifs variés, et tout particulièrement sur les denrées alimentaires : l'aliment contaminé par le champignon moisit.

Le développement non souhaité de moisissures sur une denrée est associé à de multiples nuisances : modification de l'aspect de l'aliment et de ses caractéristiques organoleptiques et chimiques . Ces défauts conduisent généralement à la l'élimination des produits, ce qui entraîne aujourd'hui à l'échelle mondiale une perte de la production alimentaire estimée à 5 à 10 % .

Le côté inesthétique de la présence fongique fut longtemps considéré comme le préjudice majeur. Il fallut attendre 1959 pour que soit établi en France le premier diagnostic de mycotoxicose typique due à l'ingestion par des vaches laitières de jeunes plantules contaminées par une moisissure. En 1960, 100 000 dindons d'élevages britanniques mouraient après avoir consommé des farines contaminées par Aspergillus flavus ; cette hécatombe et d'autres qui suivirent dans les élevages, confirmèrent que le développement de moisissures nuisibles sur les aliments pouvait être associé à une synthèse de substances toxiques pour l'animal : les mycotoxines.

I - MOISISSURES ET ALIMENTS

A / Le contaminant

Les moisissures comme tous les champignons sont des Eucaryotes. La cellule fongique a fondamentalement la même organisation que la cellule animale et végétale, et sa physiologie présente beaucoup d'analogies avec celle de la cellule animale. La cellule fongique comme la cellule végétale et à la différence de la cellule animale est entourée d'une paroi. La paroi des moisissures par ses caractéristiques physiques (épaisseur, structure partiellement fibrillaire et pluristratifiée) et ses caractéristiques chimiques (absence de cellulose remplacée par d'autres glucanes, présence de chitine et souvent de pigments mélaniques) est une structure rigide interdisant la phagocytose mais protégeant la cellule des agressions mécaniques, physiques et chimiques.

Les moisissures sont des microorganismes pluricellulaires filamenteux. Leurs filaments ou hyphes ont un allongement strictement apical.

Sur un substrat nutritif solide la colonie fongique est constituée d'un réseau d'hyphes appelé mycélium. La marge de la colonie envahit le substrat, alors que les régions centrales plus âgées donnent naissance à des organes de multiplication et de reproduction.

B/ La contamination

A l'observation macroscopique, les régions âgées de la colonie apparaissent recouvertes d'une poudre dispersée au moindre courant d'air. Sous le microscope, cette poudre est constituée d'une multitude de particules vivantes, les conidies, mesurant le plus souvent quelques microns, uni ou pluricellulaires . Les conidies sont par leur nombre et leurs dimensions des cellules de multiplication et de dissémination ; chacune d'entre elle est capable de produire une colonie lorsque les conditions sont favorables. Toutes les moisissures altérant les aliments et la plupart des champignons ont une multiplication asexuée dont les modalités sont caractéristiques des groupes, des genres et des espèces (Cole et Kendrick, 1981).

L'efficacité de ce procédé est telle que les moisissures sous la forme de filaments ou de conidies sont présentes dans presque tous les milieux : sol - atmosphère - eaux. La terre, les végétaux et les déchets organiques sont généralement les habitats primaires des moisissures. Les phénomènes météorologiques (turbulences atmosphériques, pluies) les activités humaines (en particulier travaux de terrassements) et les animaux, surtout les insectes, sont secondairement les facteurs de dispersion des conidies. Ces dernières sont toujours inévitablement présentes dans l'atmosphère (Cole et Kendrick, 1981).

Les populations conidiennes atmosphériques fluctuent qualitativement et quantitativement avec la géographie, les saisons et les climats. A Lyon, 1 m³ d'air renferme de 250 à 1500 conidies.

Quels que soient le pays et la saison, la flore fongique de base est contituée par les genres Penicillium , Aspergillus et Cladosporium .

En atmosphère non contrôlée, la contamination fongique, notamment par les Aspergillus, Cladosporium et Penicillium , est un risque permanent et pratiquement inévitable : les végétaux, les graines et les fruits sont naturellement contaminés.

C / Colonisation des denrées alimentaires

La contamination d'un aliment par une conidie n'implique pas toujours une altération ultérieure du produit. Seul, le développement d'une colonie fongique est significatif d'une altération.

Les champignons sont des microorganismes hétérotrophes. La moisissure pour croître et se multiplier doit puiser dans le milieu des matières organiques structurales et énergétiques. La paroi rigide empêche la cellule fongique de phagocyter sa nourriture ; seuls des nutriments simples et solubles peuvent être absorbés, ce qui implique une hydrolyse préalable des macromolécules. Cette exigence est généralement satisfaite grâce à un potentiel enzymatique exceptionnel . La cellule fongique est particulièrement riche en dépolymérases. Sous l'action de ces enzymes excrétées dans l'environnement des polymères complexes comme la cellulose, la lignine et les composés pectiques peuvent être "digérés" par de nombreux champignons. Quant à l'azote, les moisissures l'assimilent aussi bien sous forme organique que minérale.

Un substrat pour être propice au développement des microorganismes doit non seulement renfermer des substances carbonées et azotées assimilables, mais il doit en outre les renfermer en proportions convenables . Le rapport C/N pour une croissance optimale des bactéries et des champignons est compris entre 8/1 et 12/1. Alors que les bactéries craignent généralement les milieux nutritifs à C/N élevé (c'est-à-dire voisins de 30), les champignons pour la plupart s'en accommodent très bien ; certains tels que les Trichoderma et les Fusarium peuvent même croître sur des matériaux très déficitaires en azote comme les chaumes et les pailles ( C/N > 80).

Il apparaît donc que les aliments en général et les matières premières végétales en particulier sont tous des substrats convenables pour les moisissures. Mais le saprophytisme de ces microorganismes et par conséquent leur croissance ne peuvent être mis en oeuvre que si le milieu renferme de l'eau libre.

* Activité en eau (aw) des aliments et croissance fongique

Sans eau libre il ne peut y avoir diffusion des exoenzymes fongiques dans l'environnement jusqu'au substrat ; ensuite, après la dépolymérisation du substrat, il ne peut y avoir diffusion des molécules simples à l'intérieur de la cellule fongique. L'activité en eau (aw) d'un aliment exprime la quantité d'eau libre disponible dans l'aliment pour la croissance des microorganismes ; l'aw d'un aliment dépend de ses caractéristiques chimiques c'est-à-dire de l'eau retenue par les sels, sucres et protéines, et de ses caractéristiques physiques (porosité, polarité, mouillabilité). Ce paramètre peut varier de 0 ( pour des substrats dans lesquels toute l'eau est retenue) à 1 (pour des substrats dont toute l'eau est disponible). Cette valeur maximale de l'aw n'est obtenue que pour de l'eau pure, elle ne permet donc pas la croissance des microorganismes. Il existe une relation directe entre l'humidité relative atmosphérique et l'aw d'une denrée : aw = HR .

100

Les champignons sont plus tolérants à une aw faible que les bactéries ; la plupart se développent bien pour des activités en eau voisines de 0,85. Beaucoup de produits pauvres en eau libre non altérables par les bactéries peuvent donc l'être par les champignons (Corry, 1987).

Les activités en eau inférieures à 0,60 ne sont pas compatibles avec la croissance fongique mais elles ne tuent pas les conidies . Le chocolat, les épices, les aliments déshydratés, les laits en poudre protégés de la réhydratation sont à l'abri d'une altération fongique .

Les moisissures toxinogènes les plus dangereuses sont pour la plupart xérotolérantes ; elles peuvent coloniser les aliments pauvres en eau comme les céréales d'autant plus facilement que pour ces faibles activités en eau elles n'ont plus la concurrence des autres microorganismes.

* pH des aliments et croissance fongique

En ce qui concerne le pH, les champignons sont encore beaucoup plus tolérants que les bactéries ; alors que ces dernières exigent souvent des pH compris entre 7 et 8, la plupart des champignons se développent normalement à des pH compris entre 3 et 8 , leur croissance optimale étant généralement obtenue pour des pH compris entre 5 et 6.

En raison de leur acidité (pH < 6) de nombreux aliments tels que les légumes, les fruits et la viande sont beaucoup plus exposés à une altération fongique que bactérienne.

* tension d'oxygène et croissance fongique

Sans exception, les moisissures ont besoin d'oxygène pour une croissance normale. Mais pour beaucoup d'entre elles, le développement n'est pas ou peu affecté par des teneurs 10 fois plus faibles ( 2,1 %) que celles de l'atmosphère . Byssochlamys fulva et B.nivea peuvent même pousser avec 0,27 % d'oxygène. Les denrées conditionnées sous faible tension d'oxygène ne sont donc pas à l'abri des moisissures.

* température et croissance fongique

Les champignons sont généralement mésophiles. Leur croissance hyphale est optimale entre 20 et 25deg.C ; elle est souvent faible à 5deg. et 35deg.C. Les conidies des espèces mésophiles ne germent pas en dessous de 5deg.C mais restent viables très longtemps ; des températures inférieures à -20deg.C ne tuent pas les conidies.

Beaucoup de moisissures nuisibles notamment Penicillium expansum, P. verrucosum, P. viridicatum sont psychrotrophes. Elles peuvent se développer lentement à des températures inférieures à 4deg.C. Ces moisissures sont fréquemment impliquées dans l'altération d'aliments conservés au froid. Les carcasses de viandes fraîches stockées trop longtemps en chambre froide sont recouvertes de colonies fongiques polychromes parmi lesquelles Cladosporium herbarum est l'espèce prédominante.

Les moisissures nuisibles "thermophiles" sont rares. Aspergillus flavus dont la xérotolérance a précédemment été soulignée, se développe de 12deg. à 48deg.C avec un optimum situé entre 25deg. et 32deg.C. Les caractéristiques physiologiques de cette espèce en font la moisissure la plus fréquemment impliquée dans la détérioration des aliments, matières premières ou produits de transformation (Pitt et Hocking, 1985).

Arsenal enzymatique varié, tolérance à des pH très acides, à des teneurs en eau très faible, et à des taux d'oxygène bas, croissance de 0deg.C à 40deg.C, expliquent que les moisissures puissent coloniser pratiquement tous les aliments. En raison de la croissance strictement apicale et de la ramification subapicale des hyphes , la colonie fongique sur milieu solide, contrairement à la colonie bactérienne, ne reste pas localisée au site contaminé. Les hyphes avancent continuellement sur et dans le substrat vers des régions nutritivement neuves, occupant grâce aux rameaux latéraux toute la surface comestible. Une contamination fongique des aliments est plus facilement détectable qu'une altération bactérienne car beaucoup plus envahissante.

II - MOISISSURES ET MYCOTOXINES

A/ Définitions

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires toxiques produits par les champignons filamenteux. Parmi les quelques 3000 métabolites secondaires fongiques connus et les 432 molécules toxiques répertoriées en 1985, plus de 100 étaient expérimentalement toxiques pour les mammifères (Scott, 1988).

Au laboratoire, en culture fermée c'est-à-dire en milieu nutritif non renouvelé (Batch), les mycotoxines comme tous les métabolites secondaires sont synthétisées et excrétées dans le milieu dès la fin de la phase exponentielle de la croissance fongique et pendant toute la phase stationnaire. En culture continue, avec un milieu nutritif renouvelé (par exemple chemostat) la synthèse des mycotoxines nécessite des taux spécifiques de croissance très inférieurs au taux de croissance maximal obtenu lorsque les conditions nutritives sont optimales.

Le métabolisme secondaire assure la transformation des métabolites primaires ou shunte des voies métaboliques devenues momentanément inutiles en raison du ralentissement ou de l'arrêt de la croissance fongique . Lorsque les conditions du milieu l'imposent, tous les champignons élaborent des métabolites secondaires . Le rôle de ces molécules pour la vie du champignon n'est généralement pas connu. Bien qu'elles soient le plus souvent excrétées dans le milieu, les mycotoxines ne sont pas des déchets puisqu' elles ne sont pas synthétisées lorsque la croissance fongique est intensive.

B/ Mycotoxines d'importance contemporaine

1 - Inventaire

Aujourd'hui une trentaine de mycotoxines ont été trouvées dans les matières premières brutes ou transformées et dans la viande et le lait des animaux consommateurs d'aliments contaminés. Ce sont en particulier les aflatoxines, les alcaloïdes de l'ergot du seigle, les alternariols, la citrinine, l'acide cyclopiazonique, l'islanditoxine, les ochratoxines, l'acide pénicillique, la patuline, la P.R. toxine, la stérigmatocystine, les mycotoxines trémorgéniques, les trichothécènes et la zéaralénone. Beaucoup de ces toxines sont responsables d'intoxications sérieuses et parfois même mortelles chez l'homme et l'animal.

Incontestablement, les aflatoxines B1 et M1 sont les plus dangereuses des mycotoxines en raison de leur toxicité aigüe et chronique , de leur fréquence dans les aliments ou boissons de consommation courante et de leur universalité ; elles contaminent les denrées alimentaires sous presque toutes les latitudes (Jelinek et al. , 1989).

Les trichothécènes sont au 2ème rang des mycotoxines pour le risque sanitaire qu'elles réprésentent. Ce groupe compte une soixantaine de molécules biologiquement actives. La plus toxique est la toxine T2, la plus fréquente est la vomitoxine ou déoxynivalénol (D.O.N.). Ces 2 mycotoxines contaminent fréquemment les céréales des régions froides et tempérées ; elles sont impliquées dans les intoxications de l'homme et du bétail surtout au Canada, au Japon, aux U.S.A. et en Russie (Tanaka et al. , 1988).

La patuline ou clavacine contamine beaucoup de fruits moisis, les pommes en particulier. Le développement des jus de fruits pasteurisés en bouteille a considérablement augmenté l'importance de cette toxine. L'acidité, le conditionnement sous de faibles tensions d'oxygène et le traitement thermique des jus de fruits sélectionnent souvent Byssochlamys nivea espèce productrice de patuline. Cette espèce, par ailleurs acidophile et capable de se développer en atmosphère très pauvre en oxygène, forme des spores sexuées (ascospores) thermorésistantes qui survivent après un traitement de 1 à 12 min. à 90deg.C. La contamination fongique dans ce cas n'est pas due à un manque d'hygiène lors du conditionnement : le champignon est apporté avec les fruits (Jelinek et al. , 1989).

Parmi la dizaine d'ochratoxines connues, l'ochratoxine A est actuellement la seule importante en tant que contaminant des aliments, essentiellement des céréales. Mais contrairement à la plupart des autres mycotoxines qui ne sont pas détectables dans les viandes, l'ochratoxine A peut être trouvée en quantités parfois importantes (10-920 ug/kg) dans les rognons de porcs et les charcuteries fumées (Jelinek et al. , 1989).

La zéaralénone doit son importance contemporaine aux nouvelles techniques d'alimentation du bétail qui privilégient souvent le maïs et les fourrages ensilés. La mauvaise protection aux intempéries des maïs conservés en cribs, le tassement insuffisant des fourrages ensilés empêchant l'obtention de l'anaérobiose dans le silo, des zones de prélèvements mal protégées de l'air, permettent le développement des Fusarium producteurs de zéaralénone (Jelinek et al. , 1989).

2 - Structure

Les mycotoxines ont trois origines biosynthétiques principales : les polyacétates, les terpènes et les acides aminés.

Cette relative communauté d'origine n'implique pas l'uniformité structurale. Au contraire, les molécules sont très variées. Malgré cela quelques caractéristiques assez générales peuvent être dégagées.

Les mycotoxines sont de petites molécules de faible poids moléculaire : 154 pour la patuline une des plus petites, 466 pour la toxine T2 l'une des plus grosses. Leur petite taille explique qu'elles ne soient pas antigéniques.

Les mycotoxines sont pour la plupart des composés hétérocycliques."L'hétéroatome" le plus courant est l'oxygène comme chez les aflatoxines, les trichothécènes (D.O.N., T2), la zéaralénone et l'ochratoxine A. Les alcaloïdes qui dérivent des acides aminés et en particulier l'ergotamine dont le précurseur est le tryptophane , sont des hétérocycles principalement azotés.

Par ailleurs, les mycotoxines sont des hétérocycles insaturés. La présence de doubles liaisons C = C est en rapport avec la toxicité et les propriétés cancérigènes de certaines. C'est le cas des aflatoxines dont la double liaison à l'extrémité des groupements furanes permet l'addition d'O2 et la formation d'un cycle triangulaire époxyde extrêmement toxique. Cette réaction qui met en oeuvre le cytochrome P 450 est réalisée par les microsomes des cellules hépatiques. Elle transforme l'aflatoxine B1 composé peu toxique en époxyde très toxique (Sunouchi et al. , 1988).

Ceci explique, d'une part qu'une injection directe d'aflatoxine B1 dans la circulation sanguine soit suivie de peu d'effets, et d'autre part que l'aflatoxine B2 qui ne possède pas de double liaison époxydisable soit moins toxique que la B1.

Chez le D.O.N. et la T2 toxine qui sont des 12-13 époxytrichothécènes, le cycle époxyde est constitutif.

L'aflatoxine, la patuline et la zéaralénone possèdent une fonction lactone, qui habituellement est peu stable en milieu alcalin. Cette propriété est mise à profit pour détoxifier certains aliments contaminés par l'aflatoxine B1. En revanche, le cycle lactone bien protégé de la zéaralénone est relativement stable à l'hydrolyse.

Enfin, il faut souligner une propriété physique importante des aflatoxines B1, B2 et G1, G2, de l'ochratoxine A, de la patuline et de la zéaralénone ; ces toxines sous l'action des rayons U.V. longs émettent une fluorescence caractéristique. En particulier, les aflatoxines B ont une fluorescence bleue (Blue) alors que celle des aflatoxines G est verte (Green). Cette caractéristique est essentielle pour la conception des méthodes de détection et de dosage.

3 - Effets biologiques

Les données dont nous disposons ont trois origines différentes ; l'expérimentation sur des cellules bactériennes ou animales et sur des animaux de laboratoire, les observations cliniques et les enquêtes épidémiologiques.

Aujourd'hui indiscutablement les mycotoxines doivent être classées parmi les toxiques naturels les plus puissants que l'on connaisse. Chez le rat, animal de sensibilité moyenne, la DL 50 (= Dose Létale qui tue 50 % des animaux testés) est souvent de quelques mg/kg.

Les trichothécènes avec des DL 50 de 0,5 à 1 mg/kg possèdent l'une des plus fortes toxicités.

De ce point de vue la zéaralénone est sans doute la moins dangereuse avec des DL 50 de 1 à 20 g/kg. La DL 50 des aflatoxines est de 5,5 à 7,4 mg/kg.

L'ingestion de doses massives de mycotoxines est heureusement encore exceptionnelle mais la pratique d'un élevage à l'alimentation peu diversifiée et intensive a conduit à de nombreuses intoxications sérieuses et même mortelles de bétail notamment de porcins et de volaille ayant consommé des aliments contaminés.

En fait se sont surtout les effets à long terme des doses subaigües qui sont intéressants d'un point de vue sanitaire car ce sont habituellement les doses susceptibles d'être ingérées par l'homme et les animaux. Sur ce point, le bétail ne permet pas d'observations intéressantes, l'abattage précoce des animaux empêchant le développement de signes cliniques flagrants.

Expérimentalement, il a été démontré que plusieurs mycotoxines dont les aflatoxines B1, G1 et M1, l'ochratoxine A, la zéaralénone et la T2 toxine sont cancérogènes par voie orale chez l'animal. Par ailleurs, il y a aujourd'hui de nombreuses preuves épidémiologiques qui montrent que les aflatoxines sont des facteurs de cancers primaires du foie chez l'homme.

Pour l'aflatoxine B1, chez des rats dont la ration alimentaire quotidienne est contaminée avec quelques ppb (ug/kg) de mycotoxine, des tumeurs commencent à apparaître pour des doses cumulées de 0,5 mg/kg.

La patuline et l'acide pénicillique par injections sous cutanées produisent des tumeurs locales chez le rat. D'autres mycotoxines notamment l'émodine et l'acide kojique sont mutagènes sur Salmonella typhimurium ; l'étude de leur carcinogénicité n'a pas encore été entreprise (Scott, 1988).

L'aflatoxine B1, l'ochratoxine A et la toxine T2 sont tératogènes.

Des études in vitro ont montré que comme l'acide pénicillique et la stérigmatocystine, l'aflatoxine B1 provoque des ruptures des chaînes d'ADN (Stark et al., 1988). En plus, de ces effets se manifestant au niveau du génome, les mycotoxines peuvent provoquer de nombreuses lésions organiques.

Les aflatoxines sont hépatotoxiques . L'ochratoxine transportée par le sang et se fixant sur l'albumine sérique s'accumule dans les tissus animaux notamment dans les plus irrigués comme les reins provoquant des néphrotoxicoses ; le porc est particulièrement sensible à cette toxine. La zéaralénone a des effets endocriniens ; la consommation d'aliments fortement contaminés par cette toxine provoquent chez le porc et la volaille des effets oestrogéniques. La citréoviridinine, les alcaloïdes de l'ergot du seigle agent du "mal des Ardents" sont des neurotoxiques.

Enfin nous citerons les effets entérotoxiques, leucopéniques et immunosuppresseurs des trichothécènes reponsables de l'A.T.A. (aleucie toxique alimentaire) humaine.

Incontestablement, les aflatoxines par leurs effets mutagènes, tératogènes, cancérogènes et hépatotoxiques sont dans l'état actuel de nos connaissances les plus dangereuses des mycotoxines.

C/ Moisissures toxinogènes et toxinogenèse

1 - Principales moisissures toxinogènes

o Si toutes les moisissures peuvent élaborer des métabolites secondaires, toutes ne synthétisent pas de mycotoxines. Ainsi les Cladosporium contaminants des céréales, des viandes et des fromages conservés au froid, mais aussi les Mucor agents en fabrication fromagère de l'accident très fréquent appelé le "Poil de Chat", ne sont pas aujourd'hui réputés " toxiques".

On peut estimer à 200 le nombre des espèces fongiques toxinogènes connues. En fait, une dizaine d'espèces seulement appartenant pour la plupart aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium ont une importance sanitaire parce que ce sont des contaminants très fréquents et parce qu'elles élaborent les mycotoxines les plus dangereuses. A l'exception des Fusarium , les moisissures toxinogènes les plus dangereuses sont souvent xérotolérantes. Elles peuvent se développer sur les substrats pauvres en eau comme les grains, les graines, les tourteaux d'oléagineux, les fruits secs, les épices et les viandes desséchées .

* Aspergillus flavus et A. parasiticus sont les principaux producteurs d'aflatoxines ; ils peuvent coloniser pratiquement toutes les matières premières végétales en particulier céréales et oléagineux pourvu que la température soit supérieure à 15deg.C et si possible comprise entre 30deg. et 40deg.C ; ce sont les moisissures nuisibles par excellence des pays chauds et humides.

* Aspergillus ochraceus est le principal producteur d'ochratoxine A. Il colonise lui aussi de très nombreux substrats et notamment les viandes sèchées.

* Penicillium cyclopium (= aurantiogriseum ) producteur d'acide cyclopiazonique et d'acide pénicillique contamine les céréales et de nombreux produits laitiers.

* Penicillium expansum producteur de la patuline est le principal agent de la pourriture des fruits autres que les agrumes, poires et pommes notamment.

Les Penicillium et les Aspergillus sont des contaminants des denrées alimentaires maltraitées mais surtout mal conservées ; ils sont considérés comme contaminants de stockage.

Les Fusarium , aux besoins en eau relativement importants, sont des contaminants des plantes en place ; parasites facultatifs des végétaux, ils peuvent et doivent les infecter avant la récolte ; dans ce cas la synthèse des mycotoxines a lieu sur l'hôte vivant. Des nombreuses espèces de Fusarium productrices de trichothécènes et de zéaralénone , Fusarium sporotrichoïdes est la plus dangereuse par sa capacité importante de synthèse de D.O.N. et de toxine T2, et par sa capacité d'infecter les plantes en toutes saisons, même pendant l'hiver si elles sont mal protégées. Fusarium graminearum principal producteur de zéaralénone se développe sur un grand nombre de graminées et notamment sur le maïs .

* "A nouvelles techniques de production et de fabrication nouveaux problèmes de contaminations fongiques". Peu souvent impliquées dans les nuisances avant 1965, Byssochlamys nivea et B. fulva ont eu brusquement un rôle sanitaire important avec l'essor de la fabrication des jus de fruits pasteurisés, conditionnés en bouteilles sous faible tension d'oxygène. Ces 2 espèces sont productrices de patuline comme P. expansum ; leur toxicité peut donc se surajouter à celle des Penicillium si les fruits utilisés et transformés sont déjà contaminés par de la patuline.

o Pour une espèce réputée toxinogène, toutes les souches ou isolats n'élaborent pas des mycotoxines.

Lors de travaux récents portant sur 36 souches d' Aspergillus flavus , 5 seulement produisaient des aflatoxines (Abarca et al. , 1988). Les raisons de ces différences sont mal connues. La présence d'un virus à double chaînes d'ARN a été démontrée chez une souche non toxinogène d' A. flavus . L'infection expérimentale d'une souche toxinogène par le virus la transforme en souche non toxinogène. Dans ce cas, le virus réprime la synthèse des toxines (Schmidt et al. , 1986).

o Pour une souche toxinogène, la capacité d'élaboration des toxines est très variable. Elle dépend de facteurs intrinsèques, comme "l'âge" chez les Fusarium dont la toxicité diminue en culture lors des repiquages successifs ; elle dépend aussi de facteurs extrinsèques comme la concurrence microbienne, la nature chimique du substrat et les conditions d'aération, de température, de pH et d'humidité. Actuellement, il est impossible de dégager des lois générales de la toxinogénèse. Selon les espèces et les conditions expérimentales ces paramètres biologiques et physico-chimiques stimulent ou freinent la production des toxines.

On peut simplement dire que pour qu'il y ait (ou qu'il y ait eu) synthèse de mycotoxine il faut qu'il y ait (ou qu'il y ait eu) croissance hyphale . D'autre part les matières premières végétales ou animales n'offrent pas des conditions optimales pour l'élaboration des mycotoxines ; ce qui revient à dire que si l'absence de moisissures sur un produit n'est pas la garantie de l'absence de mycotoxine (le champignon peut avoir disparu au cours des manipulations et transformations du produit) la présence d'une moisissure bien développée sur une denrée n'est pas non plus l'assurance d'une présence de mycotoxine (s).

En revanche, après cette note optimiste, il faut souligner qu'il est exceptionnel qu'une moisissure synthétise une seule mycotoxine. Aspergillus flavus par exemple, en même temps que l'aflatoxine B1 peut synthétiser une vingtaine d'autres mycotoxines dont les aflatoxines B2, G1, G2, M1, M2, B3, l'acide cyclopiazonique et la stérigmatocycstine. De même la production d'une mycotoxine dangereuse n'est pas toujours l'exclusivité d'une seule espèce. Alors que les aflatoxines sont l'apanage des Aspergillus du groupe flavus, l'acide pénicillique, l'ochratoxine A et la patuline sont synthétisées par de nombreux Aspergillus et Penicillium (Davis et Diener, 1987).

D/ Moisissures utiles et mycotoxines

Les industries de transformation du lait et de la viande utilisent pour levain essentiellement quatre espèces de moisissures : Geotrichum candidum, Penicillium camemberti et P. roqueforti pour l'affinage des fromages et Penicillium nalgiovense pour la couverture des saucissons. La plupart des recherches de toxines ont été réalisées avec P. camemberti et P. roqueforti .

In vitro , P. roqueforti élabore une dizaine de toxines dont la P.R. toxine de forte toxicité aigüe : chez le rat, la DL 50 par voie orale est de 110 à 145 mg/kg. Par ailleurs, comme beaucoup de Penicillium , P. roqueforti produit de l'acide pénicillique.

Ces 2 toxines n'ont pas encore été détectées dans les fromages. Il semble que les conditions de fabrication des fromages bleus, et le substrat lui même ne soient pas favorables à l'expression de la toxinogenèse de P. roqueforti , et à l'accumulation de la toxine PR et de l'acide pénicillinique (Scott, 1981)

En revanche P. camemberti peut élaborer dans le fromage une toxine, l'acide cyclopiazonique.Mais seule la croûte est significativement contaminée (0,05-1,5 ug/g ; Scott, 1981). Le fromage apparaît donc peu propice à la synthèse et à l'accumulation des mycotoxines.

Par ailleurs, il faut souligner que la capacité de toxinogénèse est très variable d'une souche à l'autre, en particulier pour P. camemberti ; en revanche pour cette espèce les conditions de maturation des fromages si elles peuvent ralentir la toxinogénèse n'affectent pas la production totale de la toxine (Le Bars et al. , 1988).

Dans le domaine de l'agroalimentaire, une sélection rigoureuse de souches de levains fongiques atoxinogènes apparaît aujourd'hui comme la meilleure prévention à la présence de mycotoxines dans les produits.

III - MYCOTOXINES ET ALIMENTS

A/ Aliments à risques

Expérimentalement, presque tous les aliments permettant une croissance hyphale et par la suite un développement mycélien, sont susceptibles d'être contaminés par des mycotoxines, y compris les épices comme la cannelle, et les fruits secs comme les figues.

1 - Produits végétaux

* Noix, oléagineux, graines de coton

Les noix au sens large et les oléagineux sous les climats chauds et humides sont des supports privilégiés pour la croissance d' Aspergillus flavus . Les graines d'arachides, de coton et les produits dérivés, farines et huiles, contiennent très souvent de l'aflatoxine B1. Les blessures par les insectes et les oiseaux, les chocs mécaniques, les stress climatiques comme l'alternance de période de sècheresse et d'humidité excessives fragilisent les plantes et favorisent la pénétration du champignon jusqu'aux graines.

Par ailleurs, en raison du développement de la production de ces denrées, excellentes sources de protéines pour le bétail, et de revenus pour les pays exportateurs du tiers monde , les conditions de sèchage et de stockage sur place sont souvent de plus en plus précaires et donc de plus en plus propices au développement d' Aspergillus flavus . Cependant, il est rare que le développement du champignon soit extensif et donne lieu à une invasion spectaculaire des stocks ; en général, seulement quelques gousses sur 1000 ou 10 000 sont contaminées par l'aflatoxine (Groopman et Donahue, 1988) mais les quantités d'aflatoxines qu'elles renferment (jusqu'à 600 000 ug/kg pour les graines de coton) sont telles qu'elles rendent tout le lot sanitairement dangereux.

Les huiles végétales non raffinées, dérivées des matières premières contaminées, sont elles aussi contaminées.

Aujourd'hui, la présence presque généralisée d'aflatoxines dans les oléagineux est un problème sanitaire majeur amplifié par le fait que souvent encore les produits trop contaminés pour être utilisés en alimentation humaine ne sont pas éliminés mais incorporés dans les aliments pour le bétail, ou consommés par le pays producteur.

* Fruits et dérivés

Les fruits pourris renferment souvent de la patuline. Cette mycotoxine est trouvée à des taux parfois très élevés de plusieurs milliers de ug/kg dans les jus de fruits et notamment dans le jus de pommes (Jelinek et al. , 1989) . Elle serait détruite lors de la fermentation alcoolique.

* Céréales

Les céréales sont sans doute les denrées alimentaires les plus longtemps sensibles aux attaques fongiques. La contamination par les mycotoxines peut en effet avoir lieu avant la récolte alors que les graminées sont encore en place, au cours du séchage, du stockage et après transformation des graines.

De manière générale, les petits grains tels que le sorgho, l'avoine, le blé, le seigle et le riz sont moins facilement contaminés que les gros comme le maïs qui pose aujourd'hui un problème sanitaire très important. Les principales mycotoxines, aflatoxines, sterigmatocystine, ochratoxine A, zéaralénone, toxine T2 et vomitoxine ont toutes été détectées dans ces produits (Jelinek, et al. , 1989).

Les facteurs de contamination sont les mêmes que ceux des oléagineux, et la répartition des toxines dans les lots contaminés est aussi très hétérogène. Au niveau des grains, c'est l'enveloppe qui est souvent la plus riche en toxine ; son élimination après broyage des grains permet de diminuer significativement le taux de toxines des farines mais pose un problème sanitaire nouveau lorsque le son est récupéré pour l'alimentation du bétail.

La cuisson en général et la panification en particulier ne doivent pas être considérées comme des procédés de détoxification des farines contaminées, seuls les alcaloïdes de l'ergot de seigle sont inactivés de manière importante ; 50 % des alcaloïdes sont en effet détruits par les traitements thermiques associés à la fabrication du pain (Scott, 1989).

2/ Produits animaux

* laits et dérivés

Les animaux producteurs de lait aux rations alimentaires contaminées par l'aflatoxine B1 excrètent dans leur lait de l'aflatoxine M1 (Milk toxin) dérivé hydroxylé et toxique de l'aflatoxine B1. Le rapport de conversion est de l'ordre de 200 / 1 (Smith et Moss, 1985).

Une étude récente réalisée en Afrique a montré que le lait de femme pouvait aussi renfermer de l'aflatoxine M1 ; 58 des 264 échantillons de lait analysés contenaient de l'aflatoxine M1 à des taux compris entre 20 et 1816 ng/l (Lamplugh et al. , 1988).

La concentration du lait contaminé sous forme de lait en poudre l'enrichit jusqu'à 8 fois en M1. Les effets des traitements thermiques sur la teneur en aflatoxine M1 du lait , pasteurisation et stérilisation, sont contreversés (Marth, 1987). Etant donnée la grande stabilité à la chaleur de l'aflatoxine B1 (300deg.C au moins sont nécessaires pour la détruire), il est probable que la M1 doit être peu affectée par les températures appliquées au lait .

La transformation du lait en beurre et fromages variés est accompagnée d'un appauvrissement en aflatoxine M1. Etant donné l'insolubilité de l'aflatoxine M1 dans les lipides du lait, la plus grande part de l'aflatoxine M1 est éliminée avec le petit lait ; le beurre ne renferme plus que 1 % et le caillé 30 % des quantités d'aflatoxine M1 initialement présentes dans le lait (Smith et Moss, 1985).

* Viandes

Comme les fromages, la viande semble un milieu peu propice à la synthèse des mycotoxines (Jay, 1987). Par ailleurs, elle est généralement peu propice aussi à l'accumulation des toxines fongiques. Pour le bétail,, le rapport de conversion est de 10 000 / 1 à 14 000 / 1. Les viandes ne sont donc pas des vecteurs importants de mycotoxines (Smith et Moss, 1985).

Les animaux consommateurs d'aliments contaminés contribuent même à réduire la quantité des mycotoxines dans la chaîne alimentaire, à l'exception de l'ochratoxine A qui s'accumule dans les tissus et organes du porc. Cette toxine pose un problème sanitaire dans les pays du nord et de l'est de l'Europe où la viande de porc est pratiquement la seule viande consommée.

B/ Détection et quantification des mycotoxines

Il n'existe pas encore de méthodes normalisées pour la détection simultanée de plusieurs mycotoxines dans un aliment (Scott, 1989). Les méthodes analytiques généralement utilisées ne permettent de détecter et de quantifier qu'une seule mycotoxine par échantillons.

Dans les aliments "homogènes" comme le lait, les huiles, le beurre, les jus de fruits, les farines, les techniques physico-chimiques d'analyses peuvent facilement détecter des quantités de mycotoxines de l'ordre du ng/g ( =ppb), et même du 1/10 de ng/g pour les aflatoxines.

Pour les grains de céréales et les graines d'oléagineux, l'hétérogénéité de la répartition des toxines au sein d'un lot contaminé pose un problème d'échantillonnage. Dans ce cas, la fiabilité des analyses et la reproductibilité des résultats imposent de gros échantillons ; 1 à 5 kg de matières premières sont nécessaires. Après broyage et homogénéisation de l'échantillon 50 g, en général, sont prélevés à fin d'analyse.

La quantification d'une mycotoxine ne peut se faire que par comparaison avec une courbe étalon établie avec des concentrations connues de la mycotoxine recherchée. Aujourd'hui encore, il est parfois difficile d'obtenir à l'état pur sous forme stable certaines mycotoxines. C'est ainsi que la détection des alcaloïdes a longtemps été gênée par l'instabilité des solutions étalons. Récemment, ces toxines ont pu être stabilisées 1 mois grâce à un mélange d'eau + propylène - glycol + éthylène - glycol (Scott, 1989).

D'une manière générale, pour des niveaux de contamination de l'ordre de 10 ppb, les techniques d'analyses mises en oeuvre permettent de récupérer souvent plus de 70 % (90-92 % pour l'aflatoxine M1) de la toxine contenue dans l'échantillon, avec une variabilité ne dépassant pas 40 % d'un laboratoire à l'autre (Scott, 1988).

La méthode préconisée pour la détection et la quantification routinière des aflatoxines, de l'ochratoxine A, de la patuline et de la zéaralénone est la chromatographie sur couche mince bidirectionnelle (TLC) associée à un dosage fluorodensitométrique qui utilise la propriété de ces molécules d'émettre naturellement une fluorescence sous l'action des U.V. longs.

Comme la plupart des mycotoxines ne sont pas volatiles, la chromatographie en phase gazeuse est souvent d'application difficile. Elle est cependant conseillée pour les trichothécènes qui n'ont pas de fluorescence naturelle et qui posent donc des problèmes en TLC et HPLC. Dans les laboratoires spécialisés, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) plus sensible et plus précise que la TLC est de plus en plus utilisée. Elle est pratiquement indispensable pour la détection et la quantification des alcaloïdes de l'ergot du seigle (Scott, 1988).

L'absence de caractères antigéniques des mycotoxines a longtemps interdit l'utilisation des méthodes immunologiques de détection.

Depuis la préparation d'anticorps antimycotoxine obtenus grâce au couplage de la toxine à une molécule antigénique comme la sérum albumine bovine, deux principales méthodes immunochimiques se sont développées : la méthode RIA (Radio Immuno assay) utilisatrice d'un marquage radioactif, et la méthode ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) utilisatrice d'un marquage enzymatique (Pestka, 1988).

Aujourd'hui, la production d'anticorps monoclonaux anti aflatoxines B1 et M1, anti zéaralénone, anti D.O.N., anti T2 toxine et anti ochratoxine A, garantit la très haute spécificité de ces méthodes (Scott, 1989).

La méthode ELISA, rapide (moins de 30 minutes), bon marché (2,5 à 6 % moins chère que les techniques physicochimiques), spécifique et sensible (détection de taux d'aflatoxine de l'ordre de 0,1-13 ng/g) supplante progressivement la méthode RIA "plus dangereuse". Elle permet d'envisager un dépistage et une quantification systématique et précoce des principales mycotoxines dans les aliments (Petska, 1988).

Les nombreux kits de détection commercialisés pour l'aflatoxine B1 et ceux bientôt commercialisables pour l'aflatoxine M1, la zéaralénone, D.O.N. et la toxine T2 tous fondés sur la méthode ELISA matérialisent bien cette tendance.

C / Réglementation (Van Egmond, 1989)

Depuis une dizaine d'années la prise de conscience du risque sanitaire associé à la présence de mycotoxines dans les aliments se généralise.

De plus en plus de pays règlementent la teneur en mycotoxines des aliments. En 1981, 39 pays proposaient des normes pour les teneurs en aflatoxines ; en 1986, 50 pays ont une règlementation pour ces substances, en particulier, aujourd'hui 14 pays au lieu de 3 en 1981 règlementent les teneurs en aflatoxines M1 .

De plus en plus de mycotoxines sont systématiquement recherchées et font l'objet d'une norme. La législation est généralement mise en place pour l'aflatoxine B1 considérée comme la plus dangereuse des mycotoxines, mais aujourd'hui les pays qui proposent une règlementation pour d'autres mycotoxines sont de plus en plus nombreux : 7 en 1981, 15 en 1986. En fonction de problèmes sanitaires locaux, la patuline, l'ochratoxine A, le déoxynivalénol, la phomopsine, la chétomine, la stachiobotryotoxine, la toxine T2 et la zéaralénone peuvent faire l'objet de tolérances spécifiques.

De plus en plus d'aliments sont contrôlés pour les teneurs en mycotoxines. Les hygiènistes et les législateurs se sont tout d'abord naturellement intéréssés à l'alimentation humaine avant de s'occuper de celle du bétail. En 1986, 35 pays au lieu de 22 en 1981 proposaient une législation pour les teneurs en aflatoxines des aliments du bétail.

Habituellement, la règlementation fixe pour les principales mycotoxines, les concentrations maximales admises en alimentation humaine et animales. En général, les maxima admissibles sont très différents d'un pays à l'autre. En alimentation humaine les maxima admissibles d'aflatoxine B1 sont généralement de 5 ug/kg

(5 ppb). La Suisse et l'Autriche ont les tolérances les plus faibles, 1 ug/kg, alors que la République de Chine a les tolérances les plus fortes avec 50 ug/kg.

Pour l'aflatoxine M1 "règlementée" dans 14 pays en 1986, les anomalies législatives sont manifestes. Bien sûr dans tous les pays les normes les plus sévères sont généralement appliquées aux laits et produits laitiers destinés aux enfants, mais en ce qui concerne les maxima admissibles, il y a 2 tendances : les pays "durs" dont fait partie la France depuis décembre 1988, aux tolérances de 0,05 ug/kg et les pays "mous" aux tolérances de 0,5 ug/kg donc 10 fois plus fortes.

En revanche, il faut souligner le consensus pour la patuline dont les teneurs maximales admissibles ont été très généralement fixées à 50 ug/kg/l.

Aujourd'hui, une harmonisation des législations nationales fondées sur des préoccupations sanitaires et non pas sur des considérations essentiellement économiques, comme c'est encore trop souvent le cas, est nécessaire.

Par ailleurs, les progrès technologiques avec l'application aux analyses multimycotoxines de la chromatographie liquide sur phase inverse et les développements de la chromatographie d'immuno affinité, devraient permettre d'une part d'augmenter le nombre de toxines règlementées, et d'autre part d'abaisser les teneurs maximales admissibles (Groopman et Donahue, 1988 ; Scott, 1989).

D - Lutte contre la présence des mycotoxines dans l'alimentation

La lutte contre la présence des mycotoxines dans l'alimentation passe d'abord par la mise en oeuvre de tous les moyens visant à empêcher la colonisation des denrées par les champignons.

Le meilleur moyen de prévénir l'installation des moisissures nuisibles sur les denrées est d'empêcher la contamination des produits par les conidies.

En industrie agroalimentaire aujourd'hui c'est une ambition raisonnable mais souvent onéreuse ; la technologie moderne (filtration, stérilisation de l'air, secteurs en surpression, désinfection des atmosphères et des surfaces) permet de "fabriquer" des aliments en conditions aseptiques.

Actuellement, en agriculture vouloir empêcher la contamination fongique relève de l'utopie, mais il est essentiel d'éviter une surinfection des grains, des graines et des fruits par des contacts intempestifs avec le sol et du matériel souillé. En plus, ces contacts sont générateurs de blessures qui favoriseront ensuite la pénétration des hyphes dans le végétal.

Lorsque la contamination fongique ne peut être évitée, il est impératif d'inhiber la germination des conidies et le développement des hyphes. De ce point de vue, le séchage mais surtout le stockage des denrées alimentaires constituent souvent des périodes à haut risque.

Des produits d'activité en eau faible, c'est-à-dire < à 0,70, théoriquement "impropres" au développement fongique ne seront réellement à l'abri des moisissures que si leur activité en eau est en tout point, spécialement en surface, constamment < à 0,70. Ceci revient à dire que lors du stockage l'humidité atmosphérique relative des locaux doit rester rigoureusement égale à celle du produit stocké et si possible inférieure ou égale à 70 % : une augmentation ou une diminution de l'humidité de l'air conduit dans les 2 cas, mais pour des raisons inverses, à une augmentation de l'activité en eau en surface du produit .

En ce qui concerne le froid comme moyen de protection contre les attaques fongiques, seules les congélations à des températures inférieures ou égales à -20deg.C garantissent un effet fongistatique. Il faut souligner que des températures plus basses par exemple -80deg.C n'ont pas d'effet stérilisant ; la congélation pour les conidies comme pour les virus, les bactéries et les aliments est un procédé de conservation ! ...

Les substances antifongiques lorsque leur utilisation est autorisée, comme c'est le cas pour le traitement des cultures, doivent être choisies en fonction des espèces fongiques à éliminer et appliquées en respectant les doses. En effet, la plupart des antifongiques sont des poisons non seulement de la cellule fongique mais aussi des cellules animales et végétales.

En France et en alimentation humaine, l'utilisation des additifs antifongiques (propionate, sorbate de calcium, natamicine) n'est autorisée que pour les emballages. Les antifongiques comme le bénomyl, l'éthoxyquine, la diphénylamine et le thiabendazole ne sont applicables sur les fruits et légumes qu'après récolte.

L'emploi des radiations ionisantes sur des produits emballés donc protégés des recontaminations, l'emploi du phosphure d'hydrogène (P H3) qui ne laisse aucun résidu, sont peut-être des solutions d'avenir.

Lorsqu'une moisissure s'est développée sur une denrée, l'appréciation correcte du risque sanitaire impose une détermination exacte de l'espèce ; c'est là un travail de spécialiste.

Bien que la présence d'une moisissure sur un aliment ne soit pas systématiquement associée à la présence de mycotoxines, les denrées "moisies" doivent être éliminées. L'essor du tri mécanisé pour les grains et les graines devrait être accompagné d'une réduction significative du taux de mycotoxines dans ces produits.

Enfin, en dernier ressort et essentiellement pour l'aflatoxine B1, lorsque la présence de toxines est probable et que le tri n'est pas possible, certains aliments peuvent être dans certains cas seulement détoxifiés. Le raffinage des huiles d'arachides éliminent les aflatoxines ; pour les aliments destinés au bétail, les traitements alcalins notamment par le gaz ammoniac (ammoniation) inactivent les aflatoxines en rompant la fonction lactone et permettent de détoxifier les tourteaux d'arachides.

CONCLUSIONS

Aujourd'hui, les mycotoxines posent un réel problème sanitaire à l'échelle mondiale.

Les aflatoxines sont, sans aucun doute, responsables de cancers du foie chez l'homme. Par ailleurs , beaucoup de mycotoxines dont les trichothécènes et la zéaralénone, en raison de leur affinité pour les lipides, pourraient être la cause des effets délétères des graisses animales et de certaines huiles végétales.

En outre, la toxicité des mycotoxines pourrait être aggravée par une exposition concommitante de l'homme et de l'animal à d'autres poisons comme les pesticides modernes (organophosphorés par exemple) qui inhibent de nombreuses enzymes et notamment les enzymes capables de détoxifier certaines mycotoxines (Schoendal, 1983, 1988).

Mais, il serait exagéré de considérer les champignons comme nuisibles dans leur ensemble. Suivant le cas, ils peuvent être agents d'affinage et de bioconversion, producteurs d'antibiotiques, de stéroïdes, d'acides organiques et d'enzymes. Les espèces utiles sont vraisemblablement plus nombreuses que les espèces nuisibles. C'est à nous de savoir d'abord les reconnaître pour ensuite pouvoir éliminer ou améliorer, et même tranformer les espèces dangereuses.

Sur ce point, l'industrie agroalimentaire, utilisatrice de ferments fongiques doit donner l'exemple. Elle peut, avec l'aide de la génétique, en sélectionnant des souches non toxinogènes contribuer déjà à réduire la dispersion des mycotoxines dans l'alimentation.

Il est temps aujourd'hui de donner une nouvelle impulsion à la lutte contre la prolifération des mycotoxines dans les aliments.

La sensibilisation au problème et la motivation pour l'application des méthodes prophylactiques passent obligatoirement :

1) par l'information du consommateur qui doit connaître les quantités de mycotoxines dans les aliments à risque.

2) par la mise en place et l'application d'une règlementation internationale cohérente.

Ces mesures sont réalisables à condition bien sûr de faire passer la santé avant les intérêts particuliers. A nous de choisir......

Remerciements au Docteur C. CHAUBEAU-DUFFOUR, Vétérinaire - Inspecteur en chef au C.N.F.T.S.V. pour la documentation qu'elle nous a spontanément proposée et à Madame C. BÄRTSCHI pour la réalisation "typographique" du manuscrit.

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ANTIFONGIQUES

Règlementation

propionate de Ca

sorbate de Ca

natamycine = pimaricine

pour emballage exclusivement

LEVAINS

Sélection

HYGIENE

Asepsie

DETOXIFICATION INDUSTRIES AGRO-ALIMENTAIRES RAFFINAGE

Ammoniation Huiles végétales Alimentation bétail

P R O P H Y L A X I E

"ANTI - MYCOTOXINES"

AGRICULTURE

ANTIFONGIQUES

Règlementation

bénomyl, éthoxyquine

diphénylamine, thiabendazole

pour fruits après récolte

VEGETAUX RESISTANTS CULTURES SECHAGE TR I

STOCKAGE

ANTIFONGIQUES

systémiques

de préférence

ANTI - STRESS Aw = H.R. % locaux =

éviter : CONSTANTE

- variations importantes

d'humidité

- blessures mécaniques

MOISISSURES - MYCOTOXINES ET ALIMENTS :

DU RISQUE A LA PREVENTION

J. BERTHIER et G. VALLA

Université Claude Bernard Lyon I

Laboratoire de Mycologie : Biosystématique et Nuisances Fongiques

43, Bd du 11 novembre 1918 - Bât. 405

69622 Villeurbanne Cedex

INTRODUCTION

Au sein du règne des champignons renfermant suivant les auteurs de 65 000 à 100 000 espèces différentes, les moisissures constituent un ensemble hétérogène d'environ 20 000 espèces. Ces microorganismes eucaryotes appartiennent en majorité à 3 classes : Zygomycètes, Deutéromycètes et Ascomycètes. Ce sont des champignons microscopiques filamenteux possédant la capacité de se développer sur des substrats nutritifs variés, et tout particulièrement sur les denrées alimentaires : l'aliment contaminé par le champignon moisit.

Le développement non souhaité de moisissures sur une denrée est associé à de multiples nuisances : modification de l'aspect de l'aliment et de ses caractéristiques organoleptiques et chimiques . Ces défauts conduisent généralement à la l'élimination des produits, ce qui entraîne aujourd'hui à l'échelle mondiale une perte de la production alimentaire estimée à 5 à 10 % .

Le côté inesthétique de la présence fongique fut longtemps considéré comme le préjudice majeur. Il fallut attendre 1959 pour que soit établi en France le premier diagnostic de mycotoxicose typique due à l'ingestion par des vaches laitières de jeunes plantules contaminées par une moisissure. En 1960, 100 000 dindons d'élevages britanniques mouraient après avoir consommé des farines contaminées par Aspergillus flavus ; cette hécatombe et d'autres qui suivirent dans les élevages, confirmèrent que le développement de moisissures nuisibles sur les aliments pouvait être associé à une synthèse de substances toxiques pour l'animal : les mycotoxines.

I - MOISISSURES ET ALIMENTS

A / Le contaminant

Les moisissures comme tous les champignons sont des Eucaryotes. La cellule fongique a fondamentalement la même organisation que la cellule animale et végétale, et sa physiologie présente beaucoup d'analogies avec celle de la cellule animale. La cellule fongique comme la cellule végétale et à la différence de la cellule animale est entourée d'une paroi. La paroi des moisissures par ses caractéristiques physiques (épaisseur, structure partiellement fibrillaire et pluristratifiée) et ses caractéristiques chimiques (absence de cellulose remplacée par d'autres glucanes, présence de chitine et souvent de pigments mélaniques) est une structure rigide interdisant la phagocytose mais protégeant la cellule des agressions mécaniques, physiques et chimiques.

Les moisissures sont des microorganismes pluricellulaires filamenteux. Leurs filaments ou hyphes ont un allongement strictement apical.

Sur un substrat nutritif solide la colonie fongique est constituée d'un réseau d'hyphes appelé mycélium. La marge de la colonie envahit le substrat, alors que les régions centrales plus âgées donnent naissance à des organes de multiplication et de reproduction.

B/ La contamination

A l'observation macroscopique, les régions âgées de la colonie apparaissent recouvertes d'une poudre dispersée au moindre courant d'air. Sous le microscope, cette poudre est constituée d'une multitude de particules vivantes, les conidies, mesurant le plus souvent quelques microns, uni ou pluricellulaires . Les conidies sont par leur nombre et leurs dimensions des cellules de multiplication et de dissémination ; chacune d'entre elle est capable de produire une colonie lorsque les conditions sont favorables. Toutes les moisissures altérant les aliments et la plupart des champignons ont une multiplication asexuée dont les modalités sont caractéristiques des groupes, des genres et des espèces (Cole et Kendrick, 1981).

L'efficacité de ce procédé est telle que les moisissures sous la forme de filaments ou de conidies sont présentes dans presque tous les milieux : sol - atmosphère - eaux. La terre, les végétaux et les déchets organiques sont généralement les habitats primaires des moisissures. Les phénomènes météorologiques (turbulences atmosphériques, pluies) les activités humaines (en particulier travaux de terrassements) et les animaux, surtout les insectes, sont secondairement les facteurs de dispersion des conidies. Ces dernières sont toujours inévitablement présentes dans l'atmosphère (Cole et Kendrick, 1981).

Les populations conidiennes atmosphériques fluctuent qualitativement et quantitativement avec la géographie, les saisons et les climats. A Lyon, 1 m³ d'air renferme de 250 à 1500 conidies.

Quels que soient le pays et la saison, la flore fongique de base est contituée par les genres Penicillium , Aspergillus et Cladosporium .

En atmosphère non contrôlée, la contamination fongique, notamment par les Aspergillus, Cladosporium et Penicillium , est un risque permanent et pratiquement inévitable : les végétaux, les graines et les fruits sont naturellement contaminés.

C / Colonisation des denrées alimentaires

La contamination d'un aliment par une conidie n'implique pas toujours une altération ultérieure du produit. Seul, le développement d'une colonie fongique est significatif d'une altération.

Les champignons sont des microorganismes hétérotrophes. La moisissure pour croître et se multiplier doit puiser dans le milieu des matières organiques structurales et énergétiques. La paroi rigide empêche la cellule fongique de phagocyter sa nourriture ; seuls des nutriments simples et solubles peuvent être absorbés, ce qui implique une hydrolyse préalable des macromolécules. Cette exigence est généralement satisfaite grâce à un potentiel enzymatique exceptionnel . La cellule fongique est particulièrement riche en dépolymérases. Sous l'action de ces enzymes excrétées dans l'environnement des polymères complexes comme la cellulose, la lignine et les composés pectiques peuvent être "digérés" par de nombreux champignons. Quant à l'azote, les moisissures l'assimilent aussi bien sous forme organique que minérale.

Un substrat pour être propice au développement des microorganismes doit non seulement renfermer des substances carbonées et azotées assimilables, mais il doit en outre les renfermer en proportions convenables . Le rapport C/N pour une croissance optimale des bactéries et des champignons est compris entre 8/1 et 12/1. Alors que les bactéries craignent généralement les milieux nutritifs à C/N élevé (c'est-à-dire voisins de 30), les champignons pour la plupart s'en accommodent très bien ; certains tels que les Trichoderma et les Fusarium peuvent même croître sur des matériaux très déficitaires en azote comme les chaumes et les pailles ( C/N > 80).

Il apparaît donc que les aliments en général et les matières premières végétales en particulier sont tous des substrats convenables pour les moisissures. Mais le saprophytisme de ces microorganismes et par conséquent leur croissance ne peuvent être mis en oeuvre que si le milieu renferme de l'eau libre.

* Activité en eau (aw) des aliments et croissance fongique

Sans eau libre il ne peut y avoir diffusion des exoenzymes fongiques dans l'environnement jusqu'au substrat ; ensuite, après la dépolymérisation du substrat, il ne peut y avoir diffusion des molécules simples à l'intérieur de la cellule fongique. L'activité en eau (aw) d'un aliment exprime la quantité d'eau libre disponible dans l'aliment pour la croissance des microorganismes ; l'aw d'un aliment dépend de ses caractéristiques chimiques c'est-à-dire de l'eau retenue par les sels, sucres et protéines, et de ses caractéristiques physiques (porosité, polarité, mouillabilité). Ce paramètre peut varier de 0 ( pour des substrats dans lesquels toute l'eau est retenue) à 1 (pour des substrats dont toute l'eau est disponible). Cette valeur maximale de l'aw n'est obtenue que pour de l'eau pure, elle ne permet donc pas la croissance des microorganismes. Il existe une relation directe entre l'humidité relative atmosphérique et l'aw d'une denrée : aw = HR

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Les champignons sont plus tolérants à une aw faible que les bactéries ; la plupart se développent bien pour des activités en eau voisines de 0,85. Beaucoup de produits pauvres en eau libre non altérables par les bactéries peuvent donc l'être par les champignons (Corry, 1987).

Les activités en eau inférieures à 0,60 ne sont pas compatibles avec la croissance fongique mais elles ne tuent pas les conidies . Le chocolat, les épices, les aliments déshydratés, les laits en poudre protégés de la réhydratation sont à l'abri d'une altération fongique .

Les moisissures toxinogènes les plus dangereuses sont pour la plupart xérotolérantes ; elles peuvent coloniser les aliments pauvres en eau comme les céréales d'autant plus facilement que pour ces faibles activités en eau elles n'ont plus la concurrence des autres microorganismes.

* pH des aliments et croissance fongique

En ce qui concerne le pH, les champignons sont encore beaucoup plus tolérants que les bactéries ; alors que ces dernières exigent souvent des pH compris entre 7 et 8, la plupart des champignons se développent normalement à des pH compris entre 3 et 8 , leur croissance optimale étant généralement obtenue pour des pH compris entre 5 et 6.

En raison de leur acidité (pH < 6) de nombreux aliments tels que les légumes, les fruits et la viande sont beaucoup plus exposés à une altération fongique que bactérienne.

* tension d'oxygène et croissance fongique

Sans exception, les moisissures ont besoin d'oxygène pour une croissance normale. Mais pour beaucoup d'entre elles, le développement n'est pas ou peu affecté par des teneurs 10 fois plus faibles ( 2,1 %) que celles de l'atmosphère . Byssochlamys fulva et B.nivea peuvent même pousser avec 0,27 % d'oxygène. Les denrées conditionnées sous faible tension d'oxygène ne sont donc pas à l'abri des moisissures.

* température et croissance fongique

Les champignons sont généralement mésophiles. Leur croissance hyphale est optimale entre 20 et 25deg.C ; elle est souvent faible à 5deg. et 35deg.C. Les conidies des espèces mésophiles ne germent pas en dessous de 5deg.C mais restent viables très longtemps ; des températures inférieures à -20deg.C ne tuent pas les conidies.

Beaucoup de moisissures nuisibles notamment Penicillium expansum, P. verrucosum, P. viridicatum sont psychrotrophes. Elles peuvent se développer lentement à des températures inférieures à 4deg.C. Ces moisissures sont fréquemment impliquées dans l'altération d'aliments conservés au froid. Les carcasses de viandes fraîches stockées trop longtemps en chambre froide sont recouvertes de colonies fongiques polychromes parmi lesquelles Cladosporium herbarum est l'espèce prédominante.

Les moisissures nuisibles "thermophiles" sont rares. Aspergillus flavus dont la xérotolérance a précédemment été soulignée, se développe de 12deg. à 48deg.C avec un optimum situé entre 25deg. et 32deg.C. Les caractéristiques physiologiques de cette espèce en font la moisissure la plus fréquemment impliquée dans la détérioration des aliments, matières premières ou produits de transformation (Pitt et Hocking, 1985).

Arsenal enzymatique varié, tolérance à des pH très acides, à des teneurs en eau très faible, et à des taux d'oxygène bas, croissance de 0deg.C à 40deg.C, expliquent que les moisissures puissent coloniser pratiquement tous les aliments. En raison de la croissance strictement apicale et de la ramification subapicale des hyphes , la colonie fongique sur milieu solide, contrairement à la colonie bactérienne, ne reste pas localisée au site contaminé. Les hyphes avancent continuellement sur et dans le substrat vers des régions nutritivement neuves, occupant grâce aux rameaux latéraux toute la surface comestible. Une contamination fongique des aliments est plus facilement détectable qu'une altération bactérienne car beaucoup plus envahissante.

II - MOISISSURES ET MYCOTOXINES

A/ Définitions

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires toxiques produits par les champignons filamenteux. Parmi les quelques 3000 métabolites secondaires fongiques connus et les 432 molécules toxiques répertoriées en 1985, plus de 100 étaient expérimentalement toxiques pour les mammifères (Scott, 1988).

Au laboratoire, en culture fermée c'est-à-dire en milieu nutritif non renouvelé (Batch), les mycotoxines comme tous les métabolites secondaires sont synthétisées et excrétées dans le milieu dès la fin de la phase exponentielle de la croissance fongique et pendant toute la phase stationnaire. En culture continue, avec un milieu nutritif renouvelé (par exemple chemostat) la synthèse des mycotoxines nécessite des taux spécifiques de croissance très inférieurs au taux de croissance maximal obtenu lorsque les conditions nutritives sont optimales.

Le métabolisme secondaire assure la transformation des métabolites primaires ou shunte des voies métaboliques devenues momentanément inutiles en raison du ralentissement ou de l'arrêt de la croissance fongique . Lorsque les conditions du milieu l'imposent, tous les champignons élaborent des métabolites secondaires . Le rôle de ces molécules pour la vie du champignon n'est généralement pas connu. Bien qu'elles soient le plus souvent excrétées dans le milieu, les mycotoxines ne sont pas des déchets puisqu' elles ne sont pas synthétisées lorsque la croissance fongique est intensive.

B/ Mycotoxines d'importance contemporaine

1 - Inventaire

Aujourd'hui une trentaine de mycotoxines ont été trouvées dans les matières premières brutes ou transformées et dans la viande et le lait des animaux consommateurs d'aliments contaminés. Ce sont en particulier les aflatoxines, les alcaloïdes de l'ergot du seigle, les alternariols, la citrinine, l'acide cyclopiazonique, l'islanditoxine, les ochratoxines, l'acide pénicillique, la patuline, la P.R. toxine, la stérigmatocystine, les mycotoxines trémorgéniques, les trichothécènes et la zéaralénone. Beaucoup de ces toxines sont responsables d'intoxications sérieuses et parfois même mortelles chez l'homme et l'animal.

Incontestablement, les aflatoxines B1 et M1 sont les plus dangereuses des mycotoxines en raison de leur toxicité aigüe et chronique , de leur fréquence dans les aliments ou boissons de consommation courante et de leur universalité ; elles contaminent les denrées alimentaires sous presque toutes les latitudes (Jelinek et al. , 1989).

Les trichothécènes sont au 2ème rang des mycotoxines pour le risque sanitaire qu'elles réprésentent. Ce groupe compte une soixantaine de molécules biologiquement actives. La plus toxique est la toxine T2, la plus fréquente est la vomitoxine ou déoxynivalénol (D.O.N.). Ces 2 mycotoxines contaminent fréquemment les céréales des régions froides et tempérées ; elles sont impliquées dans les intoxications de l'homme et du bétail surtout au Canada, au Japon, aux U.S.A. et en Russie (Tanaka et al. , 1988).

La patuline ou clavacine contamine beaucoup de fruits moisis, les pommes en particulier. Le développement des jus de fruits pasteurisés en bouteille a considérablement augmenté l'importance de cette toxine. L'acidité, le conditionnement sous de faibles tensions d'oxygène et le traitement thermique des jus de fruits sélectionnent souvent Byssochlamys nivea espèce productrice de patuline. Cette espèce, par ailleurs acidophile et capable de se développer en atmosphère très pauvre en oxygène, forme des spores sexuées (ascospores) thermorésistantes qui survivent après un traitement de 1 à 12 min. à 90deg.C. La contamination fongique dans ce cas n'est pas due à un manque d'hygiène lors du conditionnement : le champignon est apporté avec les fruits (Jelinek et al. , 1989).

Parmi la dizaine d'ochratoxines connues, l'ochratoxine A est actuellement la seule importante en tant que contaminant des aliments, essentiellement des céréales. Mais contrairement à la plupart des autres mycotoxines qui ne sont pas détectables dans les viandes, l'ochratoxine A peut être trouvée en quantités parfois importantes (10-920 ug/kg) dans les rognons de porcs et les charcuteries fumées (Jelinek et al. , 1989).

La zéaralénone doit son importance contemporaine aux nouvelles techniques d'alimentation du bétail qui privilégient souvent le maïs et les fourrages ensilés. La mauvaise protection aux intempéries des maïs conservés en cribs, le tassement insuffisant des fourrages ensilés empêchant l'obtention de l'anaérobiose dans le silo, des zones de prélèvements mal protégées de l'air, permettent le développement des Fusarium producteurs de zéaralénone (Jelinek et al. , 1989).

2 - Structure

Les mycotoxines ont trois origines biosynthétiques principales : les polyacétates, les terpènes et les acides aminés.

Cette relative communauté d'origine n'implique pas l'uniformité structurale. Au contraire, les molécules sont très variées. Malgré cela quelques caractéristiques assez générales peuvent être dégagées.

Les mycotoxines sont de petites molécules de faible poids moléculaire : 154 pour la patuline une des plus petites, 466 pour la toxine T2 l'une des plus grosses. Leur petite taille explique qu'elles ne soient pas antigéniques.

Les mycotoxines sont pour la plupart des composés hétérocycliques."L'hétéroatome" le plus courant est l'oxygène comme chez les aflatoxines, les trichothécènes (D.O.N., T2), la zéaralénone et l'ochratoxine A. Les alcaloïdes qui dérivent des acides aminés et en particulier l'ergotamine dont le précurseur est le tryptophane , sont des hétérocycles principalement azotés.

Par ailleurs, les mycotoxines sont des hétérocycles insaturés. La présence de doubles liaisons C = C est en rapport avec la toxicité et les propriétés cancérigènes de certaines. C'est le cas des aflatoxines dont la double liaison à l'extrémité des groupements furanes permet l'addition d'O2 et la formation d'un cycle triangulaire époxyde extrêmement toxique. Cette réaction qui met en oeuvre le cytochrome P 450 est réalisée par les microsomes des cellules hépatiques. Elle transforme l'aflatoxine B1 composé peu toxique en époxyde très toxique (Sunouchi et al. , 1988).

Ceci explique, d'une part qu'une injection directe d'aflatoxine B1 dans la circulation sanguine soit suivie de peu d'effets, et d'autre part que l'aflatoxine B2 qui ne possède pas de double liaison époxydisable soit moins toxique que la B1.

Chez le D.O.N. et la T2 toxine qui sont des 12-13 époxytrichothécènes, le cycle époxyde est constitutif.

L'aflatoxine, la patuline et la zéaralénone possèdent une fonction lactone, qui habituellement est peu stable en milieu alcalin. Cette propriété est mise à profit pour détoxifier certains aliments contaminés par l'aflatoxine B1. En revanche, le cycle lactone bien protégé de la zéaralénone est relativement stable à l'hydrolyse.

Enfin, il faut souligner une propriété physique importante des aflatoxines B1, B2 et G1, G2, de l'ochratoxine A, de la patuline et de la zéaralénone ; ces toxines sous l'action des rayons U.V. longs émettent une fluorescence caractéristique. En particulier, les aflatoxines B ont une fluorescence bleue (Blue) alors que celle des aflatoxines G est verte (Green). Cette caractéristique est essentielle pour la conception des méthodes de détection et de dosage.

3 - Effets biologiques

Les données dont nous disposons ont trois origines différentes ; l'expérimentation sur des cellules bactériennes ou animales et sur des animaux de laboratoire, les observations cliniques et les enquêtes épidémiologiques.

Aujourd'hui indiscutablement les mycotoxines doivent être classées parmi les toxiques naturels les plus puissants que l'on connaisse. Chez le rat, animal de sensibilité moyenne, la DL 50 (= Dose Létale qui tue 50 % des animaux testés) est souvent de quelques mg/kg.

Les trichothécènes avec des DL 50 de 0,5 à 1 mg/kg possèdent l'une des plus fortes toxicités.

De ce point de vue la zéaralénone est sans doute la moins dangereuse avec des DL 50 de 1 à 20 g/kg. La DL 50 des aflatoxines est de 5,5 à 7,4 mg/kg.

L'ingestion de doses massives de mycotoxines est heureusement encore exceptionnelle mais la pratique d'un élevage à l'alimentation peu diversifiée et intensive a conduit à de nombreuses intoxications sérieuses et même mortelles de bétail notamment de porcins et de volaille ayant consommé des aliments contaminés.

En fait se sont surtout les effets à long terme des doses subaigües qui sont intéressants d'un point de vue sanitaire car ce sont habituellement les doses susceptibles d'être ingérées par l'homme et les animaux. Sur ce point, le bétail ne permet pas d'observations intéressantes, l'abattage précoce des animaux empêchant le développement de signes cliniques flagrants.

Expérimentalement, il a été démontré que plusieurs mycotoxines dont les aflatoxines B1, G1 et M1, l'ochratoxine A, la zéaralénone et la T2 toxine sont cancérogènes par voie orale chez l'animal. Par ailleurs, il y a aujourd'hui de nombreuses preuves épidémiologiques qui montrent que les aflatoxines sont des facteurs de cancers primaires du foie chez l'homme.

Pour l'aflatoxine B1, chez des rats dont la ration alimentaire quotidienne est contaminée avec quelques ppb (ug/kg) de mycotoxine, des tumeurs commencent à apparaître pour des doses cumulées de 0,5 mg/kg.

La patuline et l'acide pénicillique par injections sous cutanées produisent des tumeurs locales chez le rat. D'autres mycotoxines notamment l'émodine et l'acide kojique sont mutagènes sur Salmonella typhimurium ; l'étude de leur carcinogénicité n'a pas encore été entreprise (Scott, 1988).

L'aflatoxine B1, l'ochratoxine A et la toxine T2 sont tératogènes.

Des études in vitro ont montré que comme l'acide pénicillique et la stérigmatocystine, l'aflatoxine B1 provoque des ruptures des chaînes d'ADN (Stark et al., 1988). En plus, de ces effets se manifestant au niveau du génome, les mycotoxines peuvent provoquer de nombreuses lésions organiques.

Les aflatoxines sont hépatotoxiques . L'ochratoxine transportée par le sang et se fixant sur l'albumine sérique s'accumule dans les tissus animaux notamment dans les plus irrigués comme les reins provoquant des néphrotoxicoses ; le porc est particulièrement sensible à cette toxine. La zéaralénone a des effets endocriniens ; la consommation d'aliments fortement contaminés par cette toxine provoquent chez le porc et la volaille des effets oestrogéniques. La citréoviridinine, les alcaloïdes de l'ergot du seigle agent du "mal des Ardents" sont des neurotoxiques.

Enfin nous citerons les effets entérotoxiques, leucopéniques et immunosuppresseurs des trichothécènes reponsables de l'A.T.A. (aleucie toxique alimentaire) humaine.

Incontestablement, les aflatoxines par leurs effets mutagènes, tératogènes, cancérogènes et hépatotoxiques sont dans l'état actuel de nos connaissances les plus dangereuses des mycotoxines.

C/ Moisissures toxinogènes et toxinogenèse

1 - Principales moisissures toxinogènes

o Si toutes les moisissures peuvent élaborer des métabolites secondaires, toutes ne synthétisent pas de mycotoxines. Ainsi les Cladosporium contaminants des céréales, des viandes et des fromages conservés au froid, mais aussi les Mucor agents en fabrication fromagère de l'accident très fréquent appelé le "Poil de Chat", ne sont pas aujourd'hui réputés " toxiques".

On peut estimer à 200 le nombre des espèces fongiques toxinogènes connues. En fait, une dizaine d'espèces seulement appartenant pour la plupart aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium ont une importance sanitaire parce que ce sont des contaminants très fréquents et parce qu'elles élaborent les mycotoxines les plus dangereuses. A l'exception des Fusarium , les moisissures toxinogènes les plus dangereuses sont souvent xérotolérantes. Elles peuvent se développer sur les substrats pauvres en eau comme les grains, les graines, les tourteaux d'oléagineux, les fruits secs, les épices et les viandes desséchées .

* Aspergillus flavus et A. parasiticus sont les principaux producteurs d'aflatoxines ; ils peuvent coloniser pratiquement toutes les matières premières végétales en particulier céréales et oléagineux pourvu que la température soit supérieure à 15deg.C et si possible comprise entre 30deg. et 40deg.C ; ce sont les moisissures nuisibles par excellence des pays chauds et humides.

* Aspergillus ochraceus est le principal producteur d'ochratoxine A. Il colonise lui aussi de très nombreux substrats et notamment les viandes sèchées. * Penicillium cyclopium (= aurantiogriseum ) producteur d'acide cyclopiazonique et d'acide pénicillique contamine les céréales et de nombreux produits laitiers.

* Penicillium expansum producteur de la patuline est le principal agent de la pourriture des fruits autres que les agrumes, poires et pommes notamment.

Les Penicillium et les Aspergillus sont des contaminants des denrées alimentaires maltraitées mais surtout mal conservées ; ils sont considérés comme contaminants de stockage.

Les Fusarium , aux besoins en eau relativement importants, sont des contaminants des plantes en place ; parasites facultatifs des végétaux, ils peuvent et doivent les infecter avant la récolte ; dans ce cas la synthèse des mycotoxines a lieu sur l'hôte vivant. Des nombreuses espèces de Fusarium productrices de trichothécènes et de zéaralénone , Fusarium sporotrichoïdes est la plus dangereuse par sa capacité importante de synthèse de D.O.N. et de toxine T2, et par sa capacité d'infecter les plantes en toutes saisons, même pendant l'hiver si elles sont mal protégées. Fusarium graminearum principal producteur de zéaralénone se développe sur un grand nombre de graminées et notamment sur le maïs .

* "A nouvelles techniques de production et de fabrication nouveaux problèmes de contaminations fongiques". Peu souvent impliquées dans les nuisances avant 1965, Byssochlamys nivea et B. fulva ont eu brusquement un rôle sanitaire important avec l'essor de la fabrication des jus de fruits pasteurisés, conditionnés en bouteilles sous faible tension d'oxygène. Ces 2 espèces sont productrices de patuline comme P. expansum ; leur toxicité peut donc se surajouter à celle des Penicillium si les fruits utilisés et transformés sont déjà contaminés par de la patuline.

o Pour une espèce réputée toxinogène, toutes les souches ou isolats n'élaborent pas des mycotoxines.

Lors de travaux récents portant sur 36 souches d' Aspergillus flavus , 5 seulement produisaient des aflatoxines (Abarca et al. , 1988). Les raisons de ces différences sont mal connues. La présence d'un virus à double chaînes d'ARN a été démontrée chez une souche non toxinogène d' A. flavus . L'infection expérimentale d'une souche toxinogène par le virus la transforme en souche non toxinogène. Dans ce cas, le virus réprime la synthèse des toxines (Schmidt et al. , 1986).

o Pour une souche toxinogène, la capacité d'élaboration des toxines est très variable. Elle dépend de facteurs intrinsèques, comme "l'âge" chez les Fusarium dont la toxicité diminue en culture lors des repiquages successifs ; elle dépend aussi de facteurs extrinsèques comme la concurrence microbienne, la nature chimique du substrat et les conditions d'aération, de température, de pH et d'humidité. Actuellement, il est impossible de dégager des lois générales de la toxinogénèse. Selon les espèces et les conditions expérimentales ces paramètres biologiques et physico-chimiques stimulent ou freinent la production des toxines.

On peut simplement dire que pour qu'il y ait (ou qu'il y ait eu) synthèse de mycotoxine il faut qu'il y ait (ou qu'il y ait eu) croissance hyphale . D'autre part les matières premières végétales ou animales n'offrent pas des conditions optimales pour l'élaboration des mycotoxines ; ce qui revient à dire que si l'absence de moisissures sur un produit n'est pas la garantie de l'absence de mycotoxine (le champignon peut avoir disparu au cours des manipulations et transformations du produit) la présence d'une moisissure bien développée sur une denrée n'est pas non plus l'assurance d'une présence de mycotoxine (s).

En revanche, après cette note optimiste, il faut souligner qu'il est exceptionnel qu'une moisissure synthétise une seule mycotoxine. Aspergillus flavus par exemple, en même temps que l'aflatoxine B1 peut synthétiser une vingtaine d'autres mycotoxines dont les aflatoxines B2, G1, G2, M1, M2, B3, l'acide cyclopiazonique et la stérigmatocycstine. De même la production d'une mycotoxine dangereuse n'est pas toujours l'exclusivité d'une seule espèce. Alors que les aflatoxines sont l'apanage des Aspergillus du groupe flavus, l'acide pénicillique, l'ochratoxine A et la patuline sont synthétisées par de nombreux Aspergillus et Penicillium (Davis et Diener, 1987).

D/ Moisissures utiles et mycotoxines

Les industries de transformation du lait et de la viande utilisent pour levain essentiellement quatre espèces de moisissures : Geotrichum candidum, Penicillium camemberti et P. roqueforti pour l'affinage des fromages et Penicillium nalgiovense pour la couverture des saucissons. La plupart des recherches de toxines ont été réalisées avec P. camemberti et P. roqueforti .

In vitro , P. roqueforti élabore une dizaine de toxines dont la P.R. toxine de forte toxicité aigüe : chez le rat, la DL 50 par voie orale est de 110 à 145 mg/kg. Par ailleurs, comme beaucoup de Penicillium , P. roqueforti produit de l'acide pénicillique.

Ces 2 toxines n'ont pas encore été détectées dans les fromages. Il semble que les conditions de fabrication des fromages bleus, et le substrat lui même ne soient pas favorables à l'expression de la toxinogenèse de P. roqueforti , et à l'accumulation de la toxine PR et de l'acide pénicillinique (Scott, 1981)

En revanche P. camemberti peut élaborer dans le fromage une toxine, l'acide cyclopiazonique.Mais seule la croûte est significativement contaminée (0,05-1,5 ug/g ; Scott, 1981). Le fromage apparaît donc peu propice à la synthèse et à l'accumulation des mycotoxines.

Par ailleurs, il faut souligner que la capacité de toxinogénèse est très variable d'une souche à l'autre, en particulier pour P. camemberti ; en revanche pour cette espèce les conditions de maturation des fromages si elles peuvent ralentir la toxinogénèse n'affectent pas la production totale de la toxine (Le Bars et al. , 1988).

Dans le domaine de l'agroalimentaire, une sélection rigoureuse de souches de levains fongiques atoxinogènes apparaît aujourd'hui comme la meilleure prévention à la présence de mycotoxines dans les produits.

III - MYCOTOXINES ET ALIMENTS

A/ Aliments à risques

Expérimentalement, presque tous les aliments permettant une croissance hyphale et par la suite un développement mycélien, sont susceptibles d'être contaminés par des mycotoxines, y compris les épices comme la cannelle, et les fruits secs comme les figues.

1 - Produits végétaux

* Noix, oléagineux, graines de coton

Les noix au sens large et les oléagineux sous les climats chauds et humides sont des supports privilégiés pour la croissance d' Aspergillus flavus . Les graines d'arachides, de coton et les produits dérivés, farines et huiles, contiennent très souvent de l'aflatoxine B1. Les blessures par les insectes et les oiseaux, les chocs mécaniques, les stress climatiques comme l'alternance de période de sècheresse et d'humidité excessives fragilisent les plantes et favorisent la pénétration du champignon jusqu'aux graines.

Par ailleurs, en raison du développement de la production de ces denrées, excellentes sources de protéines pour le bétail, et de revenus pour les pays exportateurs du tiers monde , les conditions de sèchage et de stockage sur place sont souvent de plus en plus précaires et donc de plus en plus propices au développement d' Aspergillus flavus . Cependant, il est rare que le développement du champignon soit extensif et donne lieu à une invasion spectaculaire des stocks ; en général, seulement quelques gousses sur 1000 ou 10 000 sont contaminées par l'aflatoxine (Groopman et Donahue, 1988) mais les quantités d'aflatoxines qu'elles renferment (jusqu'à 600 000 ug/kg pour les graines de coton) sont telles qu'elles rendent tout le lot sanitairement dangereux.

Les huiles végétales non raffinées, dérivées des matières premières contaminées, sont elles aussi contaminées.

Aujourd'hui, la présence presque généralisée d'aflatoxines dans les oléagineux est un problème sanitaire majeur amplifié par le fait que souvent encore les produits trop contaminés pour être utilisés en alimentation humaine ne sont pas éliminés mais incorporés dans les aliments pour le bétail, ou consommés par le pays producteur.

* Fruits et dérivés

Les fruits pourris renferment souvent de la patuline. Cette mycotoxine est trouvée à des taux parfois très élevés de plusieurs milliers de ug/kg dans les jus de fruits et notamment dans le jus de pommes (Jelinek et al. , 1989) . Elle serait détruite lors de la fermentation alcoolique.

* Céréales

Les céréales sont sans doute les denrées alimentaires les plus longtemps sensibles aux attaques fongiques. La contamination par les mycotoxines peut en effet avoir lieu avant la récolte alors que les graminées sont encore en place, au cours du séchage, du stockage et après transformation des graines.

De manière générale, les petits grains tels que le sorgho, l'avoine, le blé, le seigle et le riz sont moins facilement contaminés que les gros comme le maïs qui pose aujourd'hui un problème sanitaire très important. Les principales mycotoxines, aflatoxines, sterigmatocystine, ochratoxine A, zéaralénone, toxine T2 et vomitoxine ont toutes été détectées dans ces produits (Jelinek, et al. , 1989).

Les facteurs de contamination sont les mêmes que ceux des oléagineux, et la répartition des toxines dans les lots contaminés est aussi très hétérogène. Au niveau des grains, c'est l'enveloppe qui est souvent la plus riche en toxine ; son élimination après broyage des grains permet de diminuer significativement le taux de toxines des farines mais pose un problème sanitaire nouveau lorsque le son est récupéré pour l'alimentation du bétail.

La cuisson en général et la panification en particulier ne doivent pas être considérées comme des procédés de détoxification des farines contaminées, seuls les alcaloïdes de l'ergot de seigle sont inactivés de manière importante ; 50 % des alcaloïdes sont en effet détruits par les traitements thermiques associés à la fabrication du pain (Scott, 1989).

2/ Produits animaux

* laits et dérivés

Les animaux producteurs de lait aux rations alimentaires contaminées par l'aflatoxine B1 excrètent dans leur lait de l'aflatoxine M1 (Milk toxin) dérivé hydroxylé et toxique de l'aflatoxine B1. Le rapport de conversion est de l'ordre de 200 / 1 (Smith et Moss, 1985).

Une étude récente réalisée en Afrique a montré que le lait de femme pouvait aussi renfermer de l'aflatoxine M1 ; 58 des 264 échantillons de lait analysés contenaient de l'aflatoxine M1 à des taux compris entre 20 et 1816 ng/l (Lamplugh et al. , 1988).

La concentration du lait contaminé sous forme de lait en poudre l'enrichit jusqu'à 8 fois en M1. Les effets des traitements thermiques sur la teneur en aflatoxine M1 du lait , pasteurisation et stérilisation, sont contreversés (Marth, 1987). Etant donnée la grande stabilité à la chaleur de l'aflatoxine B1 (300deg.C au moins sont nécessaires pour la détruire), il est probable que la M1 doit être peu affectée par les températures appliquées au lait .

La transformation du lait en beurre et fromages variés est accompagnée d'un appauvrissement en aflatoxine M1. Etant donné l'insolubilité de l'aflatoxine M1 dans les lipides du lait, la plus grande part de l'aflatoxine M1 est éliminée avec le petit lait ; le beurre ne renferme plus que 1 % et le caillé 30 % des quantités d'aflatoxine M1 initialement présentes dans le lait (Smith et Moss, 1985).

* Viandes

Comme les fromages, la viande semble un milieu peu propice à la synthèse des mycotoxines (Jay, 1987). Par ailleurs, elle est généralement peu propice aussi à l'accumulation des toxines fongiques. Pour le bétail,, le rapport de conversion est de 10 000 / 1 à 14 000 / 1. Les viandes ne sont donc pas des vecteurs importants de mycotoxines (Smith et Moss, 1985).

Les animaux consommateurs d'aliments contaminés contribuent même à réduire la quantité des mycotoxines dans la chaîne alimentaire, à l'exception de l'ochratoxine A qui s'accumule dans les tissus et organes du porc. Cette toxine pose un problème sanitaire dans les pays du nord et de l'est de l'Europe où la viande de porc est pratiquement la seule viande consommée.

B/ Détection et quantification des mycotoxines

Il n'existe pas encore de méthodes normalisées pour la détection simultanée de plusieurs mycotoxines dans un aliment (Scott, 1989). Les méthodes analytiques généralement utilisées ne permettent de détecter et de quantifier qu'une seule mycotoxine par échantillons.

Dans les aliments "homogènes" comme le lait, les huiles, le beurre, les jus de fruits, les farines, les techniques physico-chimiques d'analyses peuvent facilement détecter des quantités de mycotoxines de l'ordre du ng/g ( =ppb), et même du 1/10 de ng/g pour les aflatoxines.

Pour les grains de céréales et les graines d'oléagineux, l'hétérogénéité de la répartition des toxines au sein d'un lot contaminé pose un problème d'échantillonnage. Dans ce cas, la fiabilité des analyses et la reproductibilité des résultats imposent de gros échantillons ; 1 à 5 kg de matières premières sont nécessaires. Après broyage et homogénéisation de l'échantillon 50 g, en général, sont prélevés à fin d'analyse.

La quantification d'une mycotoxine ne peut se faire que par comparaison avec une courbe étalon établie avec des concentrations connues de la mycotoxine recherchée. Aujourd'hui encore, il est parfois difficile d'obtenir à l'état pur sous forme stable certaines mycotoxines. C'est ainsi que la détection des alcaloïdes a longtemps été gênée par l'instabilité des solutions étalons. Récemment, ces toxines ont pu être stabilisées 1 mois grâce à un mélange d'eau + propylène - glycol + éthylène - glycol (Scott, 1989).

D'une manière générale, pour des niveaux de contamination de l'ordre de 10 ppb, les techniques d'analyses mises en oeuvre permettent de récupérer souvent plus de 70 % (90-92 % pour l'aflatoxine M1) de la toxine contenue dans l'échantillon, avec une variabilité ne dépassant pas 40 % d'un laboratoire à l'autre (Scott, 1988).

La méthode préconisée pour la détection et la quantification routinière des aflatoxines, de l'ochratoxine A, de la patuline et de la zéaralénone est la chromatographie sur couche mince bidirectionnelle (TLC) associée à un dosage fluorodensitométrique qui utilise la propriété de ces molécules d'émettre naturellement une fluorescence sous l'action des U.V. longs.

Comme la plupart des mycotoxines ne sont pas volatiles, la chromatographie en phase gazeuse est souvent d'application difficile. Elle est cependant conseillée pour les trichothécènes qui n'ont pas de fluorescence naturelle et qui posent donc des problèmes en TLC et HPLC. Dans les laboratoires spécialisés, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) plus sensible et plus précise que la TLC est de plus en plus utilisée. Elle est pratiquement indispensable pour la détection et la quantification des alcaloïdes de l'ergot du seigle (Scott, 1988).

L'absence de caractères antigéniques des mycotoxines a longtemps interdit l'utilisation des méthodes immunologiques de détection.

Depuis la préparation d'anticorps antimycotoxine obtenus grâce au couplage de la toxine à une molécule antigénique comme la sérum albumine bovine, deux principales méthodes immunochimiques se sont développées : la méthode RIA (Radio Immuno assay) utilisatrice d'un marquage radioactif, et la méthode ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) utilisatrice d'un marquage enzymatique (Pestka, 1988).

Aujourd'hui, la production d'anticorps monoclonaux anti aflatoxines B1 et M1, anti zéaralénone, anti D.O.N., anti T2 toxine et anti ochratoxine A, garantit la très haute spécificité de ces méthodes (Scott, 1989).

La méthode ELISA, rapide (moins de 30 minutes), bon marché (2,5 à 6 % moins chère que les techniques physicochimiques), spécifique et sensible (détection de taux d'aflatoxine de l'ordre de 0,1-13 ng/g) supplante progressivement la méthode RIA "plus dangereuse". Elle permet d'envisager un dépistage et une quantification systématique et précoce des principales mycotoxines dans les aliments (Petska, 1988).

Les nombreux kits de détection commercialisés pour l'aflatoxine B1 et ceux bientôt commercialisables pour l'aflatoxine M1, la zéaralénone, D.O.N. et la toxine T2 tous fondés sur la méthode ELISA matérialisent bien cette tendance.

C / Réglementation (Van Egmond, 1989)

Depuis une dizaine d'années la prise de conscience du risque sanitaire associé à la présence de mycotoxines dans les aliments se généralise.

De plus en plus de pays règlementent la teneur en mycotoxines des aliments. En 1981, 39 pays proposaient des normes pour les teneurs en aflatoxines ; en 1986, 50 pays ont une règlementation pour ces substances, en particulier, aujourd'hui 14 pays au lieu de 3 en 1981 règlementent les teneurs en aflatoxines M1 .

De plus en plus de mycotoxines sont systématiquement recherchées et font l'objet d'une norme. La législation est généralement mise en place pour l'aflatoxine B1 considérée comme la plus dangereuse des mycotoxines, mais aujourd'hui les pays qui proposent une règlementation pour d'autres mycotoxines sont de plus en plus nombreux : 7 en 1981, 15 en 1986. En fonction de problèmes sanitaires locaux, la patuline, l'ochratoxine A, le déoxynivalénol, la phomopsine, la chétomine, la stachiobotryotoxine, la toxine T2 et la zéaralénone peuvent faire l'objet de tolérances spécifiques.

De plus en plus d'aliments sont contrôlés pour les teneurs en mycotoxines. Les hygiènistes et les législateurs se sont tout d'abord naturellement intéréssés à l'alimentation humaine avant de s'occuper de celle du bétail. En 1986, 35 pays au lieu de 22 en 1981 proposaient une législation pour les teneurs en aflatoxines des aliments du bétail.

Habituellement, la règlementation fixe pour les principales mycotoxines, les concentrations maximales admises en alimentation humaine et animales. En général, les maxima admissibles sont très différents d'un pays à l'autre. En alimentation humaine les maxima admissibles d'aflatoxine B1 sont généralement de 5 ug/kg

(5 ppb). La Suisse et l'Autriche ont les tolérances les plus faibles, 1 ug/kg, alors que la République de Chine a les tolérances les plus fortes avec 50 ug/kg.

Pour l'aflatoxine M1 "règlementée" dans 14 pays en 1986, les anomalies législatives sont manifestes. Bien sûr dans tous les pays les normes les plus sévères sont généralement appliquées aux laits et produits laitiers destinés aux enfants, mais en ce qui concerne les maxima admissibles, il y a 2 tendances : les pays "durs" dont fait partie la France depuis décembre 1988, aux tolérances de 0,05 ug/kg et les pays "mous" aux tolérances de 0,5 ug/kg donc 10 fois plus fortes.

En revanche, il faut souligner le consensus pour la patuline dont les teneurs maximales admissibles ont été très généralement fixées à 50 ug/kg/l.

Aujourd'hui, une harmonisation des législations nationales fondées sur des préoccupations sanitaires et non pas sur des considérations essentiellement économiques, comme c'est encore trop souvent le cas, est nécessaire.

Par ailleurs, les progrès technologiques avec l'application aux analyses multimycotoxines de la chromatographie liquide sur phase inverse et les développements de la chromatographie d'immuno affinité, devraient permettre d'une part d'augmenter le nombre de toxines règlementées, et d'autre part d'abaisser les teneurs maximales admissibles (Groopman et Donahue, 1988 ; Scott, 1989).

D - Lutte contre la présence des mycotoxines dans l'alimentation

La lutte contre la présence des mycotoxines dans l'alimentation passe d'abord par la mise en oeuvre de tous les moyens visant à empêcher la colonisation des denrées par les champignons.

Le meilleur moyen de prévénir l'installation des moisissures nuisibles sur les denrées est d'empêcher la contamination des produits par les conidies.

En industrie agroalimentaire aujourd'hui c'est une ambition raisonnable mais souvent onéreuse ; la technologie moderne (filtration, stérilisation de l'air, secteurs en surpression, désinfection des atmosphères et des surfaces) permet de "fabriquer" des aliments en conditions aseptiques.

Actuellement, en agriculture vouloir empêcher la contamination fongique relève de l'utopie, mais il est essentiel d'éviter une surinfection des grains, des graines et des fruits par des contacts intempestifs avec le sol et du matériel souillé. En plus, ces contacts sont générateurs de blessures qui favoriseront ensuite la pénétration des hyphes dans le végétal.

Lorsque la contamination fongique ne peut être évitée, il est impératif d'inhiber la germination des conidies et le développement des hyphes. De ce point de vue, le séchage mais surtout le stockage des denrées alimentaires constituent souvent des périodes à haut risque.

Des produits d'activité en eau faible, c'est-à-dire < à 0,70, théoriquement "impropres" au développement fongique ne seront réellement à l'abri des moisissures que si leur activité en eau est en tout point, spécialement en surface, constamment < à 0,70. Ceci revient à dire que lors du stockage l'humidité atmosphérique relative des locaux doit rester rigoureusement égale à celle du produit stocké et si possible inférieure ou égale à 70 % : une augmentation ou une diminution de l'humidité de l'air conduit dans les 2 cas, mais pour des raisons inverses, à une augmentation de l'activité en eau en surface du produit .

En ce qui concerne le froid comme moyen de protection contre les attaques fongiques, seules les congélations à des températures inférieures ou égales à -20deg.C garantissent un effet fongistatique. Il faut souligner que des températures plus basses par exemple -80deg.C n'ont pas d'effet stérilisant ; la congélation pour les conidies comme pour les virus, les bactéries et les aliments est un procédé de conservation ! ...

Les substances antifongiques lorsque leur utilisation est autorisée, comme c'est le cas pour le traitement des cultures, doivent être choisies en fonction des espèces fongiques à éliminer et appliquées en respectant les doses. En effet, la plupart des antifongiques sont des poisons non seulement de la cellule fongique mais aussi des cellules animales et végétales.

En France et en alimentation humaine, l'utilisation des additifs antifongiques (propionate, sorbate de calcium, natamicine) n'est autorisée que pour les emballages. Les antifongiques comme le bénomyl, l'éthoxyquine, la diphénylamine et le thiabendazole ne sont applicables sur les fruits et légumes qu'après récolte.

L'emploi des radiations ionisantes sur des produits emballés donc protégés des recontaminations, l'emploi du phosphure d'hydrogène (P H3) qui ne laisse aucun résidu, sont peut-être des solutions d'avenir.

Lorsqu'une moisissure s'est développée sur une denrée, l'appréciation correcte du risque sanitaire impose une détermination exacte de l'espèce ; c'est là un travail de spécialiste.

Bien que la présence d'une moisissure sur un aliment ne soit pas systématiquement associée à la présence de mycotoxines, les denrées "moisies" doivent être éliminées. L'essor du tri mécanisé pour les grains et les graines devrait être accompagné d'une réduction significative du taux de mycotoxines dans ces produits.

Enfin, en dernier ressort et essentiellement pour l'aflatoxine B1, lorsque la présence de toxines est probable et que le tri n'est pas possible, certains aliments peuvent être dans certains cas seulement détoxifiés. Le raffinage des huiles d'arachides éliminent les aflatoxines ; pour les aliments destinés au bétail, les traitements alcalins notamment par le gaz ammoniac (ammoniation) inactivent les aflatoxines en rompant la fonction lactone et permettent de détoxifier les tourteaux d'arachides.

CONCLUSIONS

Aujourd'hui, les mycotoxines posent un réel problème sanitaire à l'échelle mondiale.

Les aflatoxines sont, sans aucun doute, responsables de cancers du foie chez l'homme. Par ailleurs , beaucoup de mycotoxines dont les trichothécènes et la zéaralénone, en raison de leur affinité pour les lipides, pourraient être la cause des effets délétères des graisses animales et de certaines huiles végétales.

En outre, la toxicité des mycotoxines pourrait être aggravée par une exposition concommitante de l'homme et de l'animal à d'autres poisons comme les pesticides modernes (organophosphorés par exemple) qui inhibent de nombreuses enzymes et notamment les enzymes capables de détoxifier certaines mycotoxines (Schoendal, 1983, 1988).

Mais, il serait exagéré de considérer les champignons comme nuisibles dans leur ensemble. Suivant le cas, ils peuvent être agents d'affinage et de bioconversion, producteurs d'antibiotiques, de stéroïdes, d'acides organiques et d'enzymes. Les espèces utiles sont vraisemblablement plus nombreuses que les espèces nuisibles. C'est à nous de savoir d'abord les reconnaître pour ensuite pouvoir éliminer ou améliorer, et même tranformer les espèces dangereuses.

Sur ce point, l'industrie agroalimentaire, utilisatrice de ferments fongiques doit donner l'exemple. Elle peut, avec l'aide de la génétique, en sélectionnant des souches non toxinogènes contribuer déjà à réduire la dispersion des mycotoxines dans l'alimentation.

Il est temps aujourd'hui de donner une nouvelle impulsion à la lutte contre la prolifération des mycotoxines dans les aliments.

La sensibilisation au problème et la motivation pour l'application des méthodes prophylactiques passent obligatoirement :

1) par l'information du consommateur qui doit connaître les quantités de mycotoxines dans les aliments à risque.

2) par la mise en place et l'application d'une règlementation internationale cohérente.

Ces mesures sont réalisables à condition bien sûr de faire passer la santé avant les intérêts particuliers. A nous de choisir......

Remerciements au Docteur C. CHAUBEAU-DUFFOUR, Vétérinaire - Inspecteur en chef au C.N.F.T.S.V. pour la documentation qu'elle nous a spontanément proposée et à Madame C. BÄRTSCHI pour la réalisation "typographique" du manuscrit.